Ficha – Coloración de Grocott

Aplicación:

 La tinción de Grocott se usa para la identificación de hongos y bacterias, mayormente en muestras de pacientes con infecciones respiratorias y neumonías. Ej: infección por Pneumoystis Jirovecii en pacientes inmuno comprometidos o con HIV.

 

Principio:

 La reacción tintorial está basada en que en presencia de Ácido Peryódico, los polisacáridos de la pared celular de los hongos son oxidados a aldehídos que a su vez reducen el complejo Nitrato-Plata Metenamina produciendo una coloración café a negra debido al depósito de plata reducida, en los lugares de localización de los aldehídos.  Con esta técnica los hongos se tiñen de color negro: la mucina adquiere un color gris oscuro; las partes internas del miscelio rosa oro; el fondo aparece de color verde claro.

 

Esta técnica requiere la preparación  previa de las siguientes soluciones:

 

 A- SOLUCIÓN DE NITRATO DE PLATA al 5%.

– 5 grs de nitrato de plata

– 100 ml de agua destilada.

Guardar en frasco de vidrio oscuro.

Cabe aclarar que no debe utilizarse ningun elemento metálico para preparar esta solución.

 

 

B- SOLUCIÓN DE METENAMINA 3%

– 3 gramos de Metenamina

– 100 ml de agua destilada.

Guardar en frasco de vidrio oscuro.

 

C- SOLUCIÓN DE METENAMINA PLATA:

– 5 ml de solucion de nitrato de plata al 5%

– 95 ml de solucion de metenamina.

Gaurdar en frasco de vidrio oscuro y conservar en heladera.

 

 D- SOLUCIÓN SATURADA DE BORAX 5% :

– 5 grs de Borato de Sodio

– 100 ml de Agua Destilada.

Al ser una solución saturada siempre quedara sedimento blanco.

 

E- SOLUCIÓN DE ÁCIDO PERYÓDICO AL 1% :

(guardar en heladera)

– 1 gr. de ácido peryódico

– 100 ml de agua destilada

Conservar en la heladera en frasco de vidrio.

 

F- SOLUCION DE VERDE LUZ:

– 2 grs. de verde luz , “Light Green”

– 98 ml. de Agua Destilada –

– 2 ml. de Ácido Acético Glacial

 

Procedimiento:

1) Sumergir en alcohol la muestra previamente fijada con fijador celular aproximadamente 15 minutos. Pasado este tiempo lavar  bien el extendido con agua destilada

 

2) Con pipeta colocar sobre la muestra,  la solución de ácido peryódico por 15 minutos. Transcurrido este tiempo virar nuevamente con agua destilada.

 

3) Prepara la solución de trabajo usando

– 12 ml de agua destilada

– 12 ml solucion de metenamina plata

– 1 ml de solución de Borax

Filtrar la solución y colocarla en un coplin (previamente enjuagado con agua destilada) apto  estufa/microondas de laboratorio

 

4) Poner el preparado en el coplin con la solución de trabajo y llevarlo 40 minutos a estufa de 60° o de tener microondas apto laboratorio 30 segundos controlando en intervalos que la solución vaya tomando color caramelo (marron dorado). Controlar en microscopio el material, debemos verlo color jarabe de coca-cola.

 

5) Lavar con agua destilada y colocarle la solución de verde luz de 1 a 2 minutos. Quitar el exceso de verde luz con agua destilada. Realizar pasajes por alcohol 96, 100 y xilol para su montaje.

Nota: es importante recordar no utilizar elementos metálicos para manipular las soluciones y la muestra una vez dentro de la solución de trabajo. Debido a que las soluciones de plata precipitan en contacto con otros metales.